Krionika nije gotov postupak hlađenja, skladištenja i čekanja. Riječ je o aktivnom znanstvenom području, a razlike između postupaka očuvanja iz 1970. i onih koji se primjenjuju danas velike su i mjerljive. Svako poboljšanje očuvanosti ultrastrukture mozga izravno povećava izglede da bi buduća medicinska tehnologija mogla omogućiti oživljavanje uz očuvana sjećanja, osobnost i identitet. Ovaj članak objašnjava kako se ta struka razvija, što je do sada dokazano, što nije, i tko na tome radi.
Struka, a ne jedinstvena tehnika
Odlučujući pomak bio je prijelaz s klasičnog zamrzavanja na vitrifikaciju, odnosno pretvaranje tkiva natopljenog krioprotektantom u staklasto stanje bez stvaranja leda. Taj je pristup 1984. predložio kriobiolog Greg Fahy, a u postupcima s ljudskim pacijentima primjenjuje se od otprilike 2000. godine.
Vitrifikacija od početka nije bila potpuno riješeno rješenje, a razlog je tema sljedećeg odjeljka. Koncentracije krioprotektanta potrebne za sprječavanje stvaranja leda toliko su visoke da mogu biti toksične. Zato se pri razvoju svake vitrifikacijske otopine nastoji povećati razlika između koncentracije potrebne za vitrifikaciju i koncentracije koja uzrokuje smrtonosna oštećenja.
Četiri problema na kojima struka radi
1. Toksičnost krioprotektanta. To je središnji problem, a standardni referentni tekst navodi ga bez ublažavanja. Human Cryopreservation Procedures, čiji su autori de Wolf i Platt, a činjeničnu provjeru proveo Brian Wowk, navodi sljedeće: pravi izazov u kriobiologiji nije osmisliti otopine koje sprječavaju stvaranje leda pri sporom hlađenju, nego vitrifikacijske otopine koje nisu toksične.
Napredak nije došao u obliku jednoga velikog proboja, nego niza konkretnih poboljšanja u formuliranju otopina. Toksičnost nekih krioprotektanata opada kad ih se kombinira s drugima; Fahyjevo otkriće da DMSO neutralizira toksičnost formamida najpoznatiji je takav slučaj. Parametar nazvan qv* omogućuje predviđanje ukupne toksičnosti vitrifikacijske otopine, pa se formulacije mogu razvijati racionalnije, a ne samo empirijski. Primjena tog parametra dovela je do donekle neočekivanog rezultata: tvari koje slabije stvaraju staklasto stanje mogu pridonijeti većoj vijabilnosti. Tako je zamjena propilen glikola većom koncentracijom etilen glikola povećala staničnu vijabilnost. Sintetski inhibitori stvaranja leda pristupaju problemu s druge strane. Godine 2000. Brian Wowk i suradnici pokazali su da polimeri mogu spriječiti heterogenu nukleaciju leda. Kopolimer polivinilnog alkohola i poliglicerol, koji se prodaju pod nazivima X-1000 i Z-1000, snižavaju minimalnu koncentraciju krioprotektanta potrebnu za vitrifikaciju. Manja potrebna količina krioprotektanta znači i manju toksičnost.
Sadašnje stanje u tom području opisano je u istom referentnom tekstu. Čak i u dobro provedenim postupcima vijabilnost mozga vjerojatno se gubi u ranoj ili srednjoj fazi krioprotektivne perfuzije, zbog toksičnosti krioprotektanta i dehidracije koju uzrokuje. Očuvanje ultrastrukture i očuvanje vijabilnosti danas nisu isto, a trenutačno je moguće postići samo prvo.
2. Unošenje krioprotektanta u cijeli mozak. German i suradnici jasno objašnjavaju zašto je postupak na cijelom mozgu zahtjevniji nego na isječku tkiva. Krioprotektant mora proći kroz krvožilni sustav, no na krvno-moždanoj barijeri propusnost i hidraulička provodljivost nisu usklađene zbog visoke koncentracije akvaporina 4 u perivaskularnim nastavcima astrocita. Njihov je protokol za cijeli mozak uspio u jednom od tri pokušaja. Akvaporini se navode kao moguća meta za izravno djelovanje.
3. Vraćanje topline u tkivo. Zagrijavanje je zahtjevniji dio postupka. Pri hlađenju treba dovoljno brzo prijeći područje temperatura u kojem nastaje led. Pri zagrijavanju tkivo kroz isto temperaturno područje prolazi sporije, pa se led koji nije nastao tijekom hlađenja može stvoriti tada. Kondukcijsko zagrijavanje prenosi toplinu od površine prema unutrašnjosti, pa je ograničeno veličinom tkiva. Njemačka skupina tu granicu smješta blizu najveće veličine tkiva koju njihova metoda može obraditi. Za veće volumene potrebne su metode koje zagrijavaju cijeli volumen tkiva. Godine 2023. skupina sa Sveučilišta u Minnesoti vitrificirala je bubrege štakora, čuvala ih do 100 dana te ih zagrijala prosječnom brzinom od 63,7 °C u minuti pobuđivanjem nanočestica željeznog oksida obloženih silicijem u radiofrekvencijskom polju. Bubrezi su zatim transplantirani i održavali su život životinja. Iste godine skupina Ramona Risca u Sevilli postigla je brzinu od 217,8 °C u minuti primjenom fokusiranog ultrazvuka visokog intenziteta, koji zagrijava cijeli volumen i ne zahtijeva nanočestice u tkivu. Rad iz 2025. pokazao je primjenu vitrifikacije i nanozagrijavanja na volumenima reda veličine litre. Nijedna od tih metoda još nije primijenjena na tkivu veličine ljudskog mozga.
4. Pucanje ispod temperature staklastog prijelaza. Ispod temperature staklastog prijelaza materijal se nastavlja stezati, ali više ne može ublažavati nastala naprezanja, pa ona mogu dovesti do pucanja. Studija iz 2025. pokazala je da su pukotine povezane s toplinskim stezanjem i temperaturnim gradijentima nastalima pri brzom hlađenju. Mjere za smanjenje rizika uključuju sporo hlađenje do kriogenih temperatura i skladištenje pri srednjoj temperaturi.
Što je dokazano, i na čemu
Nalazi koji slijede poredani su prema tome što je pojedini pokus doista pokazao i na kojem je sustavu proveden.
Cijeli organ, vitrificiran i transplantiran. Fahyjeva skupina iz 21st Century Medicine objavila je 2009. godine da je zečji bubreg natopljen vitrifikacijskom otopinom M22, ohlađen na -135 °C bez stvaranja leda, zatim zagrijan i transplantiran te da je funkcionirao kao jedini bubreg životinje. To je i danas najjasniji dokaz da složeni organ može preživjeti cijeli postupak.
Ultrastruktura očuvana kroz cijeli mozak, fiksacijom. Postupak aldehidno stabilizirane krioprezervacije, opisan u časopisu Cryobiology 2015. godine, osvojio je nagradu Brain Preservation Foundation za velikog sisavca 2018. godine. Nagrada je dodijeljena za očuvanje sinaptičke povezanosti u cijelom mozgu svinje, potvrđeno trodimenzionalnom elektronskom mikroskopijom nakon zagrijavanja. Glutaraldehid najprije fiksira ultrastrukturu, čime se isključuje mogućnost biološkog oživljavanja tog tkiva. Prednosti i ograničenja tog postupka opisana su u tekstu o očuvanje bez zamrzavanja.
Ultrastruktura očuvana kroz cijeli mozak, samo vitrifikacijom. Pretisak iz 2026. autora Fahyja, Ralfa Spindlera, Briana Wowka i suradnika opisuje ultrastrukturnu i histološku krioprezervaciju mozgova sisavaca vitrifikacijom bez prethodne aldehidne fiksacije. Recenzija tog rada još nije dovršena.
Funkcija oporavljena u hipokampusu miša. U ožujku 2026. Alexander German i suradnici sa sveučilišta Erlangen-Nürnberg objavili su u časopisu PNAS rad o funkcionalnom oporavku hipokampusa odraslih miševa nakon krioprezervacije vitrifikacijom. Isječci tkiva, kao i cijeli mozak in situ, čuvani su ispod temperature staklastog prijelaza između deset minuta i sedam dana, zatim zagrijani i podvrgnuti mjerenjima. Oporavili su se membranski potencijal u mirovanju, sinaptički prijenos, metabolički odgovor i dugotrajna potencijacija. Dugotrajna potencijacija iznosila je 138,06 ± 6,90% nakon vitrifikacije u odnosu na 157,68 ± 7,14% u kontrolnoj skupini, p = 0,072, na temelju sedam odnosno osam isječaka iz sedam miševa. Ta razlika nije statistički značajna, ali uz ovako mali uzorak analiza nema dovoljnu statističku snagu ni da isključi stvarno smanjenje. Autori stoga rezultat opisuju kao kratkotrajni oporavak. Nalaz pokazuje da je stanični mehanizam učenja i pamćenja u hipokampusu miša ostao funkcionalan nakon nekoliko dana potpunog prestanka molekularne pokretljivosti. Taj se rezultat ne može izravno primijeniti na ljudski mozak, cijele organe ljudske veličine ni na duga razdoblja skladištenja. Časopis PNAS objavio je neovisni komentar o tom radu u lipnju 2026.
Živo ljudsko moždano tkivo pohranjeno i oporavljeno. Godine 2024. skupina sa sveučilišta Fudan objavila je protokol nazvan MEDY, koji se temelji na metilcelulozi, etilen glikolu, DMSO i tvari Y27632. Nakon otapanja, ljudsko moždano tkivo i neuralni organoidi zadržali su strukturu, staničnu raznolikost i neuralnu funkciju.
Mjerenje kvalitete očuvanja
Izraz kvaliteta očuvanja može značiti dvije različite stvari, a njihovo poistovjećivanje može navesti struku na zaključke koji nisu potkrijepljeni dokazima. Jedna se odnosi na stvarno postignuti stupanj očuvanja. Druga opisuje opterećenja kojima je pacijent bio izložen tijekom postupka. Obje mjere trebaju biti dio dokumentacije slučaja, ali samo prva izravno pokazuje rezultat očuvanja.
Mjere ishoda: što je očuvanje postiglo
Standardni referentni tekst navodi tri pokazatelja, a za svaki i odgovarajuću metodu mjerenja. Stupanj sprječavanja stvaranja leda procjenjuje se CT snimanjem, kojim se mogu razlikovati vitrificirana i zamrznuta područja jer se led i okolna vitrificirana otopina razlikuju po gustoći. Očuvanost ultrastrukture procjenjuje se elektronskom mikroskopijom na uzorcima moždanog tkiva volumena nekoliko mikrolitara. Vijabilnost se na istim uzorcima procjenjuje testovima, primjerice određivanjem omjera kalija i natrija. Referentni tekst jasno navodi standard: svako izvješće o slučaju trebalo bi sadržavati CT snimke i elektronske mikrografije koje dokumentiraju stupanj vitrifikacije i očuvanost ultrastrukture.
Isti referentni tekst otvoreno navodi i ograničenje treće mjere: zbog već spomenute toksičnosti trenutačno nije moguće postići visoku vijabilnost u uzorcima mozga pacijenata. Danas se dobro provedenim slučajem smatra onaj u kojem su dokumentirani vitrifikacija i očuvanost ultrastrukture, a ne vijabilnost.
Mjere izloženosti: čemu je pacijent bio izložen
S-MIX je standardizirana mjera ishemijskog opterećenja koja podatke o temperaturi i cirkulaciji u pojedinom slučaju pretvara u ekvivalentne minute ishemije pri normalnoj tjelesnoj temperaturi. Topla ishemija pritom ima veću težinu od hladne. Drugi pokazatelj jest početna brzina hlađenja prilagođena tjelesnoj masi pacijenta. Te mjere omogućuju usporedbu slučajeva i procjenu učinka promjena protokola na temelju konkretnih podataka. One opisuju uvjete u kojima je očuvanje provedeno, a ne mjere kakav je bio ishod.
Što mjeri Tomorrow.bio
U svakom našem slučaju provodi se CT snimanje kako bi se stupanj vitrifikacije dokumentirao, a ne samo pretpostavljao. CT-om smo snimili više pacijenata i objavili rezultate za više njih nego bilo koja druga organizacija za krioprezervaciju. Pojedinačna izvješća o slučajevima javno su dostupna u cijelosti. Za elektronsku mikroskopiju potrebna je izričita suglasnost za uzimanje uzoraka moždanog tkiva, pa se provodi samo ako je član dao dopuštenje. Do danas je to učinjeno u jednom slučaju.
Ta je razlika važna pri procjeni tvrdnji bilo koje organizacije o kvaliteti postupka: CT snimanje pokazuje je li nastao led, a samo elektronska mikroskopija pokazuje stanje sinapsi.
Tko na tome radi
21st Century Medicine proizvela je rezultat sa zečjim bubregom, aldehidno stabiliziranu krioprezervaciju, okvir qv*, otopinu M22 i sintetske blokatore leda. Veći dio kemije krioprotektanata koja se danas primjenjuje potječe iz te skupine, više nego iz bilo kojeg drugog izvora.
Skupina Alexandera Germana sa sveučilišta Erlangen-Nürnberg provela je prethodno opisano istraživanje funkcionalnog oporavka. German je kliničar-znanstvenik u području molekularne neurologije i suosnivač tvrtke Hiber, koja se bavi strukturnim očuvanjem mozga.
Advanced Neural Biosciences, koji su 2008. osnovali Aschwin de Wolf i Chana Phaedra, jedan je od rijetkih instituta posvećenih specifično kriobiologiji mozga. Institut se bavi vitrifikacijskim otopinama niske toksičnosti i viskoznosti, koje dobro prolaze kroz krvno-moždanu barijeru. Proučava i problem no-reflowa, odnosno nemogućnost ponovne uspostave protoka krvi kroz tkivo nakon zastoja. De Wolf je koautor standardnog referentnog teksta o postupcima na koji se ovaj članak više puta poziva.
Područje bankarstva organa razvija alate koji se mogu primijeniti i u krioprezervaciji mozga. Rad o nanozagrijavanju iz Minnesote proizašao je iz tog područja, a ne iz krionike.
Konektomika određuje granice tumačenja tih rezultata. Godine 2025. konzorcij MICrONS objavio je mapu kubnog milimetra vidnog korteksa miša koja sadrži otprilike 200.000 stanica i 523 milijuna sinapsa, rezultat višegodišnjeg rada međunarodnog konzorcija. Riječ je o malenom volumenu mozga miša, ali o više sinapsa nego što ih je itko mogao kartirati prije desetak godina.
Brain Preservation Foundation ne provodi postupke očuvanja, ali ima važnu ulogu u neovisnoj procjeni rezultata. Nagrade dodjeljuje prema objavljenim kriterijima i na temelju neovisne provjere elektronskom mikroskopijom.
Tomorrow.bio i European Biostasis Foundation djeluju na primijenjenoj strani: razvijaju protokole za pripravnost i stabilizaciju, perfuzijsku opremu, logistiku pravodobnog dolaska do pacijenta te dugotrajno skladištenje u objektu EBF u Rafzu u Švicarskoj. Ondje se trenutačno testira prvi dewar za skladištenje pri srednjoj temperaturi, veličine za ljudskog pacijenta. Drugi laboratorij gradi se u Berlinu. Većina rezultata navedenih u ovom članku potječe od drugih skupina.
Pregledni rad iz 2024. u recenziranom časopisu razmatra ovu argumentaciju i njezina ograničenja u vezi sa strukturnom očuvanju mozga. Među njegovim autorima je i Aschwin de Wolf.
Što bi predstavljalo dokaz protiv
Tri bi nalaza dovela u pitanje ovu argumentaciju, a svaki bi mogao proizaći iz aktualnih istraživačkih programa.
Kad bi se pokazalo da krioprotektant nije moguće dovesti kroz netaknutu krvno-moždanu barijeru u cijelom mozgu, rezultati dobiveni na isječcima tkiva i dalje bi bili zanimljivi, ali više ne bi bili relevantni za očuvanje cijelog mozga. Kad bi se pokazalo da sadašnji protokoli redovito uništavaju, a ne samo oštećuju sinaptičku ultrastrukturu, temeljna tvrdnja ne bi opstala. Kad bi se pokazalo da dugotrajno pamćenje uvelike ovisi o neprekidnoj električnoj aktivnosti, a ne o očuvanoj strukturi, postupkom bi se očuvalo pogrešno svojstvo.
Ništa od toga dosad nije pokazano, a dostupni dokazi u svakom slučaju upućuju na suprotno. To i dalje ostaju pitanja koja vrijedi pratiti.
Zašto je smjer razvoja bitan
Ništa od ovoga ne mijenja stav da oživljavanje trenutno nije moguće. Mijenja se brzina kojom se poboljšava stupanj očuvanosti, a upravo on određuje kakav bi materijal buduća tehnologija imala na raspolaganju. Četiri područja pridonose rješavanju različitih dijelova problema: kriobiologija, bankarstvo organa, konektomika i klinička medicina. Rezultati se prenose između njih. Mogući putovi razvoja opisani su u tekstu kako bismo mogli postići oživljavanje.
Ukratko: Istraživanja unapređuju krioprotektante, postupke očuvanja organa, mjerenje strukture mozga i metode zagrijavanja. Ti napreci mogu poboljšati kvalitetu očuvanja, ali još ne omogućuju oživljavanje ljudi.
Istražite ovaj praktični alat
Upotrijebite interaktivni alat za istraživanje pitanja u ovom članku.
Učitavanje interaktivnog alata...
Preporučeno štivo