Nakon krioprotektivne perfuzije, pacijent se ne stavlja jednostavno u tekući dušik.
Pacijenta se nekoliko dana hladi prema računalno vođenom temperaturnom programu. Senzori unutar tijela pokazuju hlade li se različite anatomske regije ujednačeno ili se među njima stvaraju opasni temperaturni gradijenti.
Tijekom spuštanja temperature mijenja se i tehnički izazov. U ranoj fazi hlađenje treba spriječiti stvaranje leda. Blizu staklastog prijelaza i ispod njega preciznost i ujednačenost temperature postaju važnije od brzine hlađenja.
Zašto je nadzirano hlađenje potrebno
Krioprotektivna sredstva omogućuju brže hlađenje uz manji rizik od stvaranja leda. Ona omogućuju da tkivo bogato vodom prijeđe u visoko viskozno, staklasto stanje umjesto da se u velikoj mjeri kristalizira.
Relevantna temperatura staklastog prijelaza, označena kao Tg, ovisi o otopini, njezinoj koncentraciji i metodi mjerenja. Riječ je o rasponu, a ne o jednom univerzalnom biološkom pragu.
Za otopine koje se upotrebljavaju u krioprezervaciji ljudi temperatura staklastog prijelaza najčešće je između -120°C i -135°C.
Iznad tog područja, presporo hlađenje može dopustiti nastajanje i rast kristala leda. Ispod tog raspona materijal se sve više ponaša kao kruta i lomljiva tvar.
Ako se površina hladi znatno brže od jezgre, različite se regije skupljaju u različitoj mjeri. Nastalo termomehaničko naprezanje može uzrokovati pukotine.
Zato postoji usko područje prihvatljivih uvjeta: prije vitrifikacije hlađenje mora biti dovoljno brzo, a nakon nje treba nadzirati gradijente i brzinu hlađenja dok tkivo prelazi u staklasto stanje.
Za objašnjenje osnovnih faznih promjena pogledajte tekst o razlici između zamrzavanja i vitrifikacije.
Uređaj za hlađenje prve generacije
Sustav prve generacije tvrtke Tomorrow.bio, nazvan V1 cooling box, uspostavio je osnovu za nadzirano hlađenje cijelog tijela.
Pacijent se smješta u posebnu izoliranu komoru. Računalo upravlja hlađenjem u komori, dok termoparovi mjere temperaturu na više mjesta.
Kontrolni sustav slijedi programiranu krivulju umjesto da neprekidno primjenjuje najjače moguće hlađenje. Podaci sa svakog senzorskog kanala bilježe se kao dio temperaturne povijesti pacijenta.
Takav se postupak bitno razlikuje od izravnog uranjanja. Uređaj može usporiti, zadržati ili promijeniti uvjete u komori ovisno o stvarnom stanju pacijenta.
Sustav druge generacije temeljen na Dewarovoj posudi
Sustav druge generacije tvrtke Tomorrow.bio omogućuje nadzirano hlađenje u posebno izrađenoj Dewarovoj posudi.
Pacijent ostaje u Dewarovoj posudi, a prilagođeni poklopac objedinjuje opremu za hlađenje, računalno upravljanje, ventile, priključke senzora i prolaze za termoparove.
Termoparovi su postavljeni na više mjesta unutar tijela pacijenta. Dodatni senzori nadziru temperaturne uvjete unutar Dewarove posude.
Sustav tako ne prati samo zadanu temperaturu. Prati i brzinu promjene temperature u različitim mjerenim regijama pacijenta.
Računalo prilagođava temperaturni gradijent i brzinu spuštanja u Dewarovoj posudi kako bi ta mjerenja ostala u granicama predviđenima protokolom.
Tijekom hlađenja veliko tijelo ne može imati potpuno jednaku temperaturu u svim točkama. Praktičan je cilj smanjiti te razlike i spriječiti da temperatura u bilo kojoj mjerenoj regiji opasno odstupi od ostalih.
Oblik Dewarove posude ujedno smanjuje broj postupaka rukovanja između nadziranog hlađenja i kriogenog skladištenja. Takva zatvorena konstrukcija može oko pacijenta održavati stabilno i simetrično okruženje.
Zadana temperatura nije temperatura pacijenta
Kontrolni sustav može brzo ohladiti okruženje. Ne može, međutim, postići da se središte ljudskog tijela istog trena izjednači s tom temperaturom.
Toplina mora putovati iz dubljih tkiva prema površini. Na uočeno temperaturno zaostajanje utječu geometrija tijela, njegov sastav, raspodjela krioprotektivnog sredstva i položaj senzora.
Zato jedan senzor u komori nije dovoljan. Okruženje nazivne temperature od -130°C ne dokazuje da je svaki mjereni dio pacijenta zaista dosegnuo -130°C.
Kontrolni sustav mora uzeti u obzir i apsolutnu temperaturu i razliku između kanala. Najsporija točka, najbrža točka i ukupni raspon daju različite važne informacije.
Kalibracija termoparova, njihov položaj i neprekidnost mjerenja također su važni. Nevjerodostojna očitanja i kvarove senzora treba jasno označiti, a ne bez napomene uključiti u prosjek krivulje.
Trofazni temperaturni program tvrtke Tomorrow.bio
Trenutačni protokol ima tri odvojene faze. Navedene vrijednosti operativni su ciljevi za ovu opremu i ovaj krioprotektivni pristup, a ne univerzalne konstante za svaki sustav vitrifikacije.
1. Brzo spuštanje prema -130°C
U prvoj se fazi temperatura pacijenta spušta s temperature suhog leda prema približno -130°C, onoliko brzo koliko to sigurno dopuštaju izmjerene temperaturne razlike.
Brzina je ovdje važna jer nedovoljno zaštićene regije još mogu stvarati led prije nego tkivo postane staklasto.
Računalo se ne oslanja samo na protekli vremenski interval. Ono nadzire termoparove i prilagođava uvjete hlađenja oko pacijenta.
2. Nadzirani povratni rast temperature prema -120°C
Nakon što se dosegne približno -130°C, aktivno hlađenje se smanjuje i temperatura pacijenta se prirodno vraća prema približno -120°C.
Ovo je faza žarenja. Blizu Tg, krioprotektivno zaštićen materijal još ima dovoljnu molekularnu pokretljivost da se dio nakupljenog mehaničkog naprezanja rastereti.
To kontrolirano zagrijavanje ujedno toplijim i hladnijim regijama daje vremena da se temperaturno približe prije nego materijal prijeđe u dublje kruto staklasto stanje.
Žarenje ne može ukloniti biološko oštećenje nastalo u ranijim fazama. Njegova svrha je uža: smanjiti temperaturne gradijente i naprezanja nastala neujednačenim stezanjem.
3. Spuštanje na -196°C brzinom od približno 1°C na sat
Od približno -120°C, cilj je spuštanje temperature brzinom od približno 1°C na sat sve dok pacijent ne dosegne temperaturu tekućeg dušika.
Taj završni interval od 76 stupnjeva traje otprilike tri dana, bez uračunatih zadržavanja i prilagodbi u kontrolnom sustavu.
Održavanje brzine od 1°C na sat u velikom tijelu s neujednačenom raspodjelom temperature zahtijeva aktivno upravljanje, a ne samo podešavanje vremenskog mjerača.
Kontrolni sustav mora neprekidno prilagođavati uvjete u Dewarovoj posudi kako bi unutarnji termoparovi pokazivali usklađen pad temperature, bez prevelikih gradijenata.
Kada jedna regija zaostaje, dodatno hlađenje okruženja moglo bi pretjerano ohladiti neku drugu regiju. Precizno upravljanje znači uskladiti podatke svih senzora, a ne pratiti samo jedno očitanje.
Zašto je faza žarenja znanstveno vjerojatna
Istraživanja vitrifikacije u velikim sustavima ukazuju na dva suprotstavljena problema: nedovoljno hlađenje iznad Tg i preveliko mehaničko naprezanje oko Tg i ispod njega.
Studija vitrifikacije ljudskog organa iz 2024. koristila je više unutarnjih sondi i zaključila da žarenje smanjuje gradijente prije prelaska materijala u staklastu fazu.
Ista studija utvrdila je da sporo hlađenje ispod područja žarenja pomaže spriječiti ponovno nastajanje velikih gradijenata i naprezanja.
Zasebno termomehaničko istraživanje utvrdilo je da žarenje blizu Tg znatno mijenja zaostalo naprezanje i smanjuje njegovu ovisnost o prethodnoj brzini hlađenja.
Ove studije potvrđuju temeljnu strategiju upravljanja procesom. One, međutim, ne potvrđuju samostalno svaku pojedinu zadanu vrijednost u protokolu tvrtke Tomorrow.bio za cijelo tijelo.
Cijela ljudska tijela veća su i termički neravnomjernija od laboratorijskih otopina ili organa. Izravna temperaturna mjerenja i snimanje nakon hlađenja i dalje su nužni.
Što računalo bilježi
Koristan podatak nije poruka koja javlja da je hlađenje završeno. Riječ je o cjelovitom vremenskom zapisu podataka za svaki temperaturni kanal.
Zapis treba prikazati brzine, zadržavanja, povratne rastove, gradijente između senzora, radnje kontrolnog sustava, alarme i svako odstupanje od planirane krivulje.
Ti su podaci važan dio procjene kvalitete krioprezervacije.
Nakon hlađenja standardizirano CT snimanje pri temperaturi tekućeg dušika može otkriti raspodjelu krioprotektivnog sredstva, led, veće deformacije i pukotine koje temperaturni podaci sami ne mogu pokazati.
Zašto se postupak završava na temperaturi tekućeg dušika
Pri normalnom atmosferskom tlaku dušik vrije na približno 77,34 kelvina, odnosno na približno -195,8°C, prema podacima NIST Chemistry WebBooka.
Skladištenje u tekućem dušiku je pasivno. Sve dok u posudi ima dovoljno tekućine, ravnoteža vrenja održava stabilno kriogeno okruženje bez mehaničkog hlađenja.
Nadzirano spuštanje temperature završava tek kada je pacijent dovoljno ohlađen za prijelaz u to stabilno stanje. Skladištenje se ne koristi kao zamjena za postupak hlađenja.
Tehnička izvedba i ograničenja sljedeće faze opisani su u tekstu o modernim kriogenim Dewarovim posudama i skladištenju pri srednjim temperaturama.
Sažetak: Tomorrow.bio koristi računalno vođeno hlađenje i unutarnje temperaturne senzore. Postupak brzo hladi do područja staklastog prijelaza, smanjuje termomehaničko naprezanje, a zatim polako spušta temperaturu prema -196°C.
Istražite ovaj praktični alat
Upotrijebite interaktivni alat za istraživanje pitanja u ovom članku.
Učitavanje interaktivnog alata...
Dodatno štivo