Vitrifikacija nije bila jedan izum. Razvijala se kako su znanstvenici rješavali niz različitih problema, od stanica i embrija do organa i, naposljetku, biostaze ljudi.
Cilj zvuči jednostavno: tkivo bogato vodom ohladiti do staklastog stanja bez stvaranja štetnog leda.
Provedba nije jednostavna. Krioprotektanti mogu biti toksični. Njihovo unošenje može oštetiti stanice. Veći uzorci hlade se neravnomjerno, u njima se nakupljaju napetosti i mnogo ih je teže ponovno zagrijati.
Suvremeni postupci zato su sustavi, a ne recepti. Njihova kvaliteta ovisi o tome funkcioniraju li zajedno kemija, perfuzija, temperatura, vrijeme, geometrija i mjerenje.
Prije vitrifikacije: hladnoća je nanosila drugu vrstu oštećenja
Ranija krioprezervacija najčešće je značila zamrzavanje. Hlađenje je usporavalo kemijske procese, ali voda je kristalizirala u led.
Led istiskuje soli i druge otopljene tvari u preostalu tekućinu. Stanice tako mogu istovremeno trpjeti mehanička pomicanja, ekstremne koncentracije otopljenih tvari, dehidraciju i oštećenje membrane.
Brže hlađenje može smanjiti kristale, ali obična voda zahtijeva izuzetno velike brzine hlađenja da bi prešla u staklasto stanje bez kemijske pomoći. To djeluje samo kod izrazito tankih uzoraka.
Povijesni problem nije bio samo doseći nisku temperaturu. Problem je bio postići je, a da se voda pritom ne preobrazi u štetne kristale.
1937. do 1938.: prvi pokusi kinetičke vitrifikacije
Basile Luyet 1937. je predložio vitrifikaciju kao strategiju biološkog očuvanja.
Godine 1938. Luyet i Eugene Hodapp izvijestili su o obnovi pokretljivosti spermija žaba izloženih tekućem zraku nakon dehidracije koncentriranom saharozom.
Izvorni pokus ovisio je o mikroskopskim filmovima i izuzetnoj brzini hlađenja. Pokazao je da je nešto fizički moguće, ali ne i protokol prilagodljiv organima.
Ovaj se pristup danas naziva kinetičkom vitrifikacijom: toplina se odvodi brže nego što led može nastati i rasti, pa kristalizacija nema vremena započeti.
Ta strategija nije primjenjiva na veće uzorke. Površina raste sporije od volumena, pa središte velikog uzorka ne uspijeva pratiti brzinu hlađenja na površini.
1949.: glicerol mijenja problem
Christopher Polge, Audrey Smith i Alan Parkes otkrili su 1949. da glicerol može zaštititi spermije tijekom očuvanja pri niskim temperaturama.
Njihov je rad u časopisu Nature pokazao praktičnu važnost krioprotektivnih tvari koje prodiru u stanice.
Te molekule ulaze u stanice, vežu vodu i smanjuju količinu leda koja se stvara pri određenoj temperaturi. Također smanjuju štetnu koncentraciju otopljenih tvari tijekom zamrzavanja.
Otkriće je preobrazilo kriobiologiju jer brzina hlađenja više nije bila jedina varijabla koju je bilo moguće kontrolirati. Kemijski sastav mogao je promijeniti način na koji voda prelazi iz jedne faze u drugu.
Otkriće je otvorilo i novi problem optimizacije. Veća količina krioprotektanta učinkovitije sprječava stvaranje leda, ali povećava kemijsko i osmotsko oštećenje.
1959. do 1968.: nove tvari i postupno unošenje
James Lovelock i Marcus Bishop izvijestili su 1959. da dimetil sulfoksid štiti nekoliko vrsta stanica od oštećenja uzrokovanih zamrzavanjem.
DMSO je lakše prolazio kroz određene membrane od glicerola. Proširio je raspon stanica koje se mogu krioprotektirati i i danas se u velikoj mjeri koristi u laboratorijskoj i kliničkoj krioprezervaciji.
John Farrant je zatim istraživao postupno povećavanje koncentracije krioprotektanta uz istodobno snižavanje temperature, pri čemu se tkivo održava u koncentriranoj tekućini bez namjernog stvaranja leda.
To je predvidjelo ključno obilježje suvremenih protokola: krioprotektant se unosi postupno, pri niskoj temperaturi, umjesto da se toplo tkivo odjednom izloži punoj koncentraciji.
Postupno unošenje ograničava osmotski udar. Niža temperatura usporava mnoge kemijske reakcije i može smanjiti štetnost izlaganja krioprotektantima.
Pokusi iz 1968. pokazali su da eritrociti mogu doseći temperaturu tekućeg dušika bez vidljivog leda uz dovoljno visoku koncentraciju glicerola.
Temeljna načela već su bila poznata. Nedostajao je praktičan način njihove primjene na složeno, prokrvljeno tkivo.
1984.: vitrifikacija postaje strategija za organe
Rad iz 1984. godine, „Vitrification as an Approach to Cryopreservation”, usmjerio je vitrifikaciju prema ozbiljnom razvoju metoda za očuvanje organa.
Strategija se ponekad nazivala ravnotežnom vitrifikacijom. Umjesto postizanja praktično nedostižne brzine hlađenja, primjenjuje se dovoljna količina krioprotektanta kako bi vitrifikacija bila moguća i u većem sustavu.
Taj pomak otkrio je tri povezana ograničenja:
- Otopina mora spriječiti stvaranje leda pri brzinama hlađenja i zagrijavanja koje je moguće postići.
- Organ mora podnijeti unošenje i uklanjanje te otopine.
- Krioprotektant mora doprijeti do svakog dijela organa prije početka hlađenja.
Otopina koja se izvrsno pokazala u epruveti mogla je zakazati u organu jer su otpor krvožilnog sustava, duljina difuzijskog puta ili toksičnost mijenjali ishod.
1985.: živi embriji vraćaju se iz staklastog stanja
William Rall i Gregory Fahy izvijestili su o krioprezervaciji mišjih embrija bez stvaranja leda pri temperaturi od -196 °C 1985. godine.
Bio je to presudan biološki dokaz. Stanice sisavaca mogle su preživjeti hlađenje i zagrijavanje nakon potpunog vitrificiranja.
Embriji su i dalje sićušni. Njihova temperatura i koncentracija otopljenih tvari mogu se promijeniti brzo i ravnomjerno, u usporedbi s odraslim organom.
Rezultat je potvrdio metodu, ali je istovremeno jasnije istaknuo problem veličine.
Problem veličine razlaže se na četiri problema
1. Toksičnost krioprotektanta
Koncentracija potrebna za vitrifikaciju može poremetiti proteine, membrane i stanični metabolizam. Toksičnost ovisi o tvari, koncentraciji, temperaturi, vremenu izloženosti i vrsti tkiva.
To znači da manja toksičnost nije svojstvo same molekule. Riječ je o svojstvu cjelokupnog protokola unošenja i uklanjanja.
2. Osmotski stres
Dodavanje koncentrirane otopine izvlači vodu iz stanica. Pri uklanjanju otopine voda može prebrzo ući natrag u stanice.
Suvremeni protokoli koriste postupno povećanje koncentracije, nosive otopine, kontrolu temperature i tvari koje ne prodiru u stanice, kako bi promjene volumena ostale u podnošljivim granicama.
3. Neravnomjerna dostava
Organ nije spremnik s jednoličnom tekućinom. Krioprotektant putuje kroz krvne žile, prolazi kroz stijenke kapilara i difundira kroz tkivo.
Ugrušci, oteklina, bolesti krvožilnog sustava, ishemija i krvno-moždana barijera mogu ostaviti neka područja ispod koncentracije potrebne za sprječavanje leda.
Zato se u suvremenoj perfuziji mjere tlak, protok, temperatura i koncentracija u venskoj krvi, a ne oslanja se samo na volumen otopine.
4. Toplinski gradijenti
Veliki objekt hladi se od površine prema unutrašnjosti. Različite temperature uzrokuju različite brzine stezanja.
U blizini temperature staklastog prijelaza i ispod nje materijal ne može brzo relaksirati napetost. Ako napetost premaši mehaničku čvrstoću, mogu se javiti pukotine.
Rješenje je bilo hlađenje kontroliranom brzinom, relaksacija napetosti u blizini Tg i sporiji prolazak kroz staklasto područje. Ta se načela danas primjenjuju pri računalno kontroliranom hlađenju ljudskih pacijenata.
1990-e i 2000-e: kombinacije tvari zamjenjuju oslanjanje na jednu tvar
Nijedan krioprotektant sam nije optimalno zadovoljavao sve zahtjeve. Znanstvenici su sve više kombinirali tvari koje prodiru u stanice, tako da svaka pridonosi učinku bez dosezanja svoje najštetnije pojedinačne koncentracije.
Nosive otopine kontrolirale su ione, pH i osmotske uvjete. Polimeri koji ne prodiru u stanice utjecali su na vodu u tkivu i ponašanje krvožilnog sustava.
Sintetski blokatori leda smanjivali su heterogenu nukleaciju i rast leda. Smanjili su ovisnost samo o visokoj koncentraciji krioprotektanta.
Otopine kao VS55, a poslije M22, predstavljale su sustavni inženjerski pristup: više tvari, blokatori leda i pažljivo osmišljena kemija nosive otopine, uz definirane protokole perfuzije i toplinske obrade.
Pregled iz 2004. o vitrifikaciji organa opisuje napredak u smanjenju toksičnosti, ograničavanju oštećenja uzrokovanih hladnoćom, kontroli nukleacije i perfuziji organa.
Važno dostignuće nije bilo to da je toksičnost nestala. Znanstvenici su naučili smanjivati toksičnost kombiniranjem kemijskog sastava, vremena izloženosti i temperature.
Pokusi na zečjim bubrezima: važni, ali laki za pretjerano tumačenje
Rad na zečjim bubrezima pokazao je da se prokrvljeni organ sisavca može napuniti složenom otopinom za vitrifikaciju, ohladiti do staklastog stanja, zagrijati i transplantirati.
Jedan izvještaj navodi da je presađeni bubreg dulje vrijeme bio jedini funkcionalni bubreg zeca.
Taj rezultat je važan zato što je prešao granicu od mikroskopskih uzoraka do funkcije čitavog organa. Nije uspostavio pouzdan klinički postupak.
Kasnija literatura navodi da dugotrajan uspjeh transplantacije nije bilo moguće pouzdano ponoviti. Ograničavajući čimbenici i dalje su bili neravnomjerna raspodjela, toksičnost i uobičajeno površinsko zagrijavanje.
To je najtočnija ocjena rezultata: važan dokaz načela, ali uz neriješene probleme ponovljivosti i veličine.
2015.: kvaliteta očuvanja postaje vidljiva na razini sinapsi
Krioprezervacija uz stabilizaciju aldehidima kombinirala je kemijsku fiksaciju, perfuziju krioprotektantom i vitrifikaciju mozgova zečeva i svinja.
Studija iz 2015. izvijestila je o jasno vidljivim membranama, sinapsama, vezikulama, mijelinu i unutarstaničnim strukturama nakon zagrijavanja i pripreme za elektronsku mikroskopiju.
Pokazala je da izvrsna neuronska ultrastruktura može preživjeti ciklus skladištenja bez stvaranja leda i u velikim mozgovima.
Nije dokazala da je oporavak funkcije moguć. Fiksacija aldehidom namjerno umrežuje biološki materijal i nespojiva je s uobičajenom obnovom žive funkcije.
Pokus je tako odgovorio na pitanje očuvanja strukture, ali ne i na pitanje mogućnosti oživljavanja.
Njegov je širi doprinos metodološki: kvalitetu očuvanja treba procjenjivati izravnim pregledom relevantnih struktura, a ne samo prema tome izgleda li uzorak staklasto.
2023.: nanozagrijavanje ublažava problem zagrijavanja bubrega štakora
Hlađenje je samo pola posla reverzibilne krioprezervacije. Zagrijavanje je često teže.
Ako je zagrijavanje presporo, led može rasti tijekom devitrifikacije. Ako toplina dolazi uglavnom s površine, toplinski gradijenti mogu izazvati pukotine u organu.
Nanozagrijavanje ublažava oba problema raspoređivanjem nanočestica željezovog oksida kroz krvožilni sustav i njihovim zagrijavanjem izmjeničnim radiofrekvencijskim magnetskim poljem.
Godine 2023. istraživači su vitrificirali bubrege štakora, čuvali ih do 100 dana, nanozagrijali ih i transplantirali.
Presađeni bubrezi u primatelja bez vlastitih bubrega ponovno su uspostavili bubrežnu funkciju nužnu za život tijekom razdoblja praćenja opisanog u izvještaju.
Uspjeh je ovisio o više od samog zagrijavanja. Istraživači su primijenili manje toksičnu formulaciju i modelirali unošenje krioprotektanta kako bi poboljšali njegovu koncentraciju u tkivu.
To je stalna pouka razvoja vitrifikacije: rješavanje jedne prepreke često otkriva sljedeću, a uspješan oporavak ovisi o cijelom nizu koraka.
2024. do 2026.: veći fizički sustavi i funkcionalno neuronsko tkivo
Godine 2024. istraživači su izvijestili o fizičkoj vitrifikaciji na razini ljudskog organa, u sustavima od 0,5 do 3 litre.
Kombinirali su unutarnju termometriju, popuštanje napetosti, kontrolirano hlađenje i mikro-CT pregled. Također su dokazali nanozagrijavanje u volumenima do 2 litre.
Najveći prikazani pokusi prvenstveno su se odnosili na fizička svojstva sustava. Izbjegavanje vidljivog leda i pukotina nužno je, ali ne dokazuje biološki oporavak organa veličine ljudskog.
Godine 2026. studija u časopisu PNAS izvijestila je o kratkotrajnom funkcionalnom oporavku hipokampalnog tkiva odraslih životinja nakon vitrifikacije i zagrijavanja.
Studija je mjerila morfologiju, odgovor mitohondrija, neuronsku podražljivost, sinaptički prijenos i dugotrajnu potencijaciju.
Obuhvatila je odsječke mišjeg mozga i pripravke cijelog mozga s malim brojem uspješnih uzoraka, a ne ljudski mozak. Njezin je značaj uži, ali i dalje bitan.
Pokazala je da neuronsko tkivo odraslih sisavaca može ponovno uspostaviti elektrofiziološke funkcije nakon vitrifikacije i zagrijavanja.
Biostaza ljudi primjenjuje znanstvene spoznaje u znatno težim uvjetima
Pokusi s bankama organa počinju sa zdravim tkivom, kontroliranim vremenom i planiranim pristupom krvožilnom sustavu.
Biostaza ljudi započinje nakon zakonski utvrđene smrti. Bolest, topla ishemija, zgrušavanje, oteklina, transport i bolesti krvožilnog sustava mogu narušiti dostavu krioprotektanta.
Trenutačni je cilj strukturno očuvanje radi moguće buduće obnove, a ne reverzibilna transplantacija danas.
Ta razlika objašnjava zašto se laboratorijski rezultati ne mogu izravno primijeniti na pacijente.
Kako je Tomorrow.bio prilagodio vitrifikaciju terenskim uvjetima
Tomorrow.bio je perfuziju cijelog tijela krioprotektantom omogućio u specijaliziranim sanitetskim vozilima. Postupak može započeti u blizini pacijenta, umjesto da se čeka prijevoz u Švicarsku.
To mijenja jedan važan čimbenik koji kemija ne može popraviti: trajanje ishemije prije početka perfuzije.
Trenutačni protokol koristi otopinu na bazi VM-1, prilagođenu terenskoj krioprotekciji i naknadnom prijevozu na suhom ledu.
Istraživački program EBF-a testirao je VM-1 u simuliranim uvjetima nakon smrti, uključujući tri sata tople ishemije.
Program je mjerio indeks refrakcije venske krvi, vrijeme perfuzije, promjenu mase, smanjenje volumena mozga i stvaranje leda te pritom ispitivao promjene perfuzata i postupka.
To je ključni izazov u ljudskim slučajevima: nije pitanje može li idealna otopina vitrificirati, nego koliko se dobro može perfundirati stvaran pacijent s ishemijskim oštećenjem.
Mjerenje je postalo dio postupka
Rana istraživanja vitrifikacije uspjeh su često utvrđivala pomoću prozirnosti, kalorimetrije, rendgenske difrakcije, preživljenja ili funkcije nakon zagrijavanja.
Biostaza ljudi ne može koristiti oporavak kao mjerilo u sadašnjem trenutku. Zato su potrebne nedestruktivne metode procjene kvalitete očuvanja koje se temelje na uzorcima tkiva.
Tomorrow.bio svakog pacijenta snima CT-om pri temperaturi tekućeg dušika, kako bi se u standardiziranim uvjetima procijenila raspodjela krioprotektanta te utvrdila prisutnost leda i makroskopski nedostaci.
Uz zaseban pristanak, mikrouzorci neuronskog tkiva mogu poslužiti za procjenu membrana, sinapsi i lokalne ultrastrukture elektronskom mikroskopijom.
Te metode i njihova ograničenja opisani su u tekstu o postupcima provjere kvalitete biostaze.
Mjerenje mijenja sam razvoj postupka. Kada nedostatak postane vidljiv i usporediv među slučajevima, promjenama kemije i protokola može se ciljano otklanjati.
Što se poboljšalo, a što nije riješeno
Suvremena vitrifikacija postigla je nekoliko stvari koje ranije zamrzavanje nije moglo:
- Očuvanje bez stvaranja leda za mnoge stanice, embrije i mala tkiva.
- Funkcionalni oporavak vitrificiranih životinjskih organa u definiranim pokusima.
- Strukturno očuvanje na razini sinapsi u fiksiranim mozgovima sisavaca.
- Računalno kontrolirano hlađenje i popuštanje napetosti u većim sustavima.
- Volumetrijsko zagrijavanje pomoću tehnologija kao što je nanozagrijavanje.
- CT i metode elektronske mikroskopije za procjenu stvarne kvalitete očuvanja.
Nije proizvela reverzibilnu krioprezervaciju cijelog ljudskog tijela.
Preostali problemi uključuju postmortalnu ishemiju, neravnomjernu perfuziju, toksičnost krioprotektanta, ograničenja koja stvara krvno-moždana barijera, toplinske gradijente u cijelom tijelu, sprječavanje pukotina te sigurno i ravnomjerno zagrijavanje.
Čak bi i uspješno strukturno očuvanje ostavilo otvorenima buduće probleme obnove, oživljavanja i liječenja izvornog uzroka smrti.
Te su razlike detaljnije objašnjene u tekstu o tehničkim izazovima reverzibilne krioprezervacije.
Sažetak: Vitrifikacija se poboljšala boljim krioprotektantima, perfuzijom, kontrolom leda, hlađenjem, zagrijavanjem i strukturnim mjerenjem. Neki problemi riješeni su u malim razmjerima, dok reverzibilnost za cijelo ljudsko tijelo ostaje neriješena.
Istražite ovaj praktični alat
Upotrijebite interaktivni alat za istraživanje pitanja u ovom članku.
Učitavanje interaktivnog alata...
Za dodatno čitanje