Vitrifikacija nije bila jedan izum. Nastala je dok su istraživači rješavali niz različitih problema na stanicama, embrijima, organima i, na kraju, na ljudskoj biostazi.
Cilj zvuči jednostavno: ohladiti tkivo bogato vodom u staklo bez stvaranja štetnog leda.
Provedba nije jednostavna. Krioprotektori mogu biti toksični. Njihovo unošenje može deformirati stanice. Veliki se objekti hlade neravnomjerno, nakupljaju naprezanje i mnogo ih je teže zagrijati.
Moderni postupci stoga su sustavi, a ne recepti. Njihova kvaliteta ovisi o zajedničkom djelovanju kemije, perfuzije, temperature, vremenskog rasporeda, geometrije i mjerenja.
Prije vitrifikacije: hladnoća je stvarala drugu ozljedu
Rana krioprezervacija uglavnom je značila smrzavanje. Hlađenje je usporavalo kemijske procese, ali voda je kristalizirala u led.
Led istiskuje soli i druge otopljene tvari u preostalu tekućinu. Stanice zato mogu istodobno doživjeti mehanički pomak, ekstremne koncentracije otopljenih tvari, dehidraciju i ozljedu membrane.
Brže hlađenje može smanjiti kristale, ali obična voda zahtijeva izvanredne brzine da bi postala staklo bez kemijske pomoći. To djeluje samo za iznimno tanke uzorke.
Povijesni problem nije bio samo postizanje niske temperature. Bio je to dolazak do te temperature bez dopuštanja da se voda preustroji u štetne kristale.
Od 1937. do 1938.: prvi kinetički pokusi vitrifikacije
Basile Luyet predložio je vitrifikaciju kao strategiju biološkog očuvanja 1937. godine.
Godine 1938. Luyet i Eugene Hodapp izvijestili su o oporavku pokretljivosti spermija žabe izloženih tekućem zraku nakon dehidracije koncentriranom saharozom.
Izvorni pokus ovisio je o mikroskopskim filmovima i ekstremnoj brzini hlađenja. Pokazao je fizikalnu mogućnost, a ne protokol za organe koji se može povećati.
Taj se pristup danas naziva kinetička vitrifikacija: nadmašiti kristalizaciju odvođenjem topline brže nego što led može nastati i rasti.
Mjerilo ga pobjeđuje. Površina raste sporije od volumena, pa središte velikog uzorka ne može dovoljno brzo pratiti površinu.
1949.: glicerol mijenja problem
Christopher Polge, Audrey Smith i Alan Parkes otkrili su 1949. da glicerol može zaštititi spermatozoide tijekom očuvanja na niskoj temperaturi.
Njihov izvještaj u časopisu Nature utvrdio je praktičnu važnost prodirućih krioprotektivnih sredstava.
Te molekule ulaze u stanice, vežu vodu i smanjuju količinu leda koji nastaje pri određenoj temperaturi. One također smanjuju štetnu koncentraciju otopljenih tvari tijekom smrzavanja.
Otkriće je preobrazilo kriobiologiju jer brzina hlađenja više nije bila jedina upravljiva varijabla. Kemijski sastav mogao je preoblikovati fazno ponašanje vode.
Uveden je i novi optimizacijski problem. Više krioprotektora učinkovitije potiskuje led, ali povećava kemijsku i osmotsku ozljedu.
Od 1959. do 1968.: više sredstava i postupno unošenje
Godine 1959. James Lovelock i Marcus Bishop izvijestili su da dimetil sulfoksid štiti nekoliko vrsta stanica od ozljede pri smrzavanju.
DMSO je prolazio kroz neke membrane lakše od glicerola. Proširio je raspon stanica koje se mogu kriozaštititi i ostaje u širokoj uporabi u laboratorijskoj i kliničkoj krioprezervaciji.
John Farrant zatim je istražio povećanje koncentracije krioprotektora uz snižavanje temperature, držeći tkivo u koncentriranoj tekućini bez namjernog stvaranja leda.
To je nagovijestilo osnovno obilježje modernih protokola: krioprotektor se unosi u koracima, pri niskoj temperaturi, umjesto izlaganja toplog tkiva punoj koncentraciji odjednom.
Postupno unošenje ograničava osmotski šok. Niža temperatura smanjuje mnoge brzine kemijskih reakcija i može učiniti inače štetno izlaganje podnošljivijim.
Godine 1968. pokusi su pokazali da crvene krvne stanice mogu dosegnuti temperaturu tekućeg dušika bez vidljivog leda pri dovoljno visokoj koncentraciji glicerola.
Pojmovni dijelovi bili su prisutni. Nedostajao je praktičan način njihove primjene na složeno, prokrvljeno tkivo.
1984.: vitrifikacija postaje strategija za organe
Rad iz 1984. pod naslovom “Vitrification as an Approach to Cryopreservation” preoblikovao je vitrifikaciju u ozbiljan put prema pohrani organa.
Ta se strategija ponekad nazivala ravnotežnom vitrifikacijom. Umjesto zahtijevanja nemoguće brzine hlađenja, upotrijebiti dovoljno krioprotektora da kritična brzina hlađenja postane ostvariva u većem sustavu.
Taj je pomak otkrio tri povezana ograničenja:
- Otopina se mora oduprijeti ledu pri ostvarivim brzinama hlađenja i zagrijavanja.
- Organ mora podnijeti unošenje i uklanjanje te otopine.
- Krioprotektor mora doprijeti do svakog područja prije početka hlađenja.
Neka bi formulacija mogla izvrsno djelovati u epruveti, a zakazati u organu jer su vaskularni otpor, difuzijska udaljenost ili toksičnost promijenili ishod.
1985.: živi embriji vraćaju se iz staklastog stanja
William Rall i Gregory Fahy izvijestili su o krioprezervaciji mišjih embrija bez leda na -196°C 1985. godine.
To je bila odlučujuća biološka demonstracija. Žive stanice sisavaca s jezgrom mogle su preživjeti hlađenje i ponovno zagrijavanje kroz posve vitrificirano stanje.
Embriji su ipak sićušni. Njihova temperatura i koncentracija mogu se mijenjati brzo i ravnomjerno u usporedbi s organom odrasle osobe.
Rezultat je potvrdio metodu, a istodobno je učinio problem mjerila vidljivijim.
Problem mjerila dijeli se na četiri problema
1. Toksičnost krioprotektora
Koncentracija potrebna za vitrifikaciju može narušiti proteine, membrane i stanični metabolizam. Toksičnost ovisi o sredstvu, koncentraciji, temperaturi, trajanju izloženosti i vrsti tkiva.
To znači da “manje toksično” nije svojstvo samo jedne molekule. To je svojstvo cjelovitog protokola unošenja i uklanjanja.
2. Osmotsko naprezanje
Dodavanje koncentrirane otopine izvlači vodu iz stanica. Njezino uklanjanje može prebrzo vratiti vodu natrag.
Moderni protokoli upotrebljavaju postupne promjene koncentracije, nosive otopine, nadzor temperature i neprodiruće otopljene tvari kako bi promjene volumena zadržali unutar podnošljivih granica.
3. Neravnomjerna dostava
Organ nije spremnik jednolične tekućine. Krioprotektor putuje kroz krvne žile, prolazi kroz stijenke kapilara i difundira kroz tkivo.
Ugrušci, edem, bolest krvnih žila, ishemija i krvno-moždana barijera mogu ostaviti neka područja ispod koncentracije potrebne za potiskivanje leda.
Zato moderna perfuzija mjeri tlak, protok, temperaturu i vensku koncentraciju umjesto da se oslanja samo na volumen otopine.
4. Toplinski gradijenti
Velik se objekt hladi izvana prema unutra. Različite temperature uzrokuju različite brzine stezanja.
Blizu staklastog prijelaza i ispod njega, materijal ne može brzo otpustiti naprezanje. Ako naprezanje premaši njegovu mehaničku čvrstoću, mogu nastati pukotine.
Rješenje je bilo hlađenje kontroliranom brzinom, žarenje blizu Tg i sporiji silazak kroz staklasto područje. Ta načela sada oblikuju računalno vođeno hlađenje ljudi.
1990-e i 2000-e: smjese zamjenjuju razmišljanje o jednom sredstvu
Nijedan pojedinačni krioprotektor nije optimirao svaki zahtjev. Istraživači su sve češće kombinirali prodiruća sredstva kako bi svako moglo pridonijeti bez dosezanja svoje najgore pojedinačne koncentracije.
Nosive otopine upravljale su ionima, pH vrijednošću i osmotskim uvjetima. Neprodirući polimeri utjecali su na vodu u tkivu i na ponašanje krvnih žila.
Sintetski blokatori leda ciljali su na heterogeno nastajanje i rast leda. Smanjili su ovisnost samo o velikoj koncentraciji krioprotektora.
Otopine kao što su VS55 i kasnije M22 predstavljale su sustavno inženjerstvo: više sredstava, blokatori leda i pomno osmišljena kemija nosive otopine u paru s određenim protokolima perfuzije i toplinskim protokolima.
Pregledni rad o vitrifikaciji organa iz 2004. opisuje napredak u smanjenju toksičnosti, ozljedi hlađenjem, nadzoru nastajanja leda i perfuziji organa.
Važan napredak nije bio nestanak toksičnosti. Istraživači su naučili raspodijeliti opterećenje na kemiju, vrijeme i temperaturu.
Pokusi na kunićjem bubregu: važni i lako precijenjeni
Rad na kunićjem bubregu pokazao je da se prokrvljeni organ sisavca može ispuniti složenom otopinom za vitrifikaciju, ohladiti u staklasto stanje, ponovno zagrijati i presaditi.
Jedan opisani bubreg održavao je kunića kao njegov jedini djelujući bubreg tijekom duljeg razdoblja.
Taj je rezultat važan jer je prešao s mikroskopskih uzoraka na rad organa. Nije uspostavio pouzdan klinički postupak.
Kasnija literatura navodi da dugotrajni uspjeh presatka nije bio ponovljivo postignut. Raspodjela, toksičnost i uobičajeno površinsko zagrijavanje ostali su ograničavajući čimbenici.
To je ispravan epistemički status: značajan dokaz načela s problemom ponovljivosti i mjerila.
2015.: kvaliteta očuvanja postaje vidljiva na razini sinapsi
Krioprezervacija stabilizirana aldehidom povezala je kemijsku fiksaciju, perfuziju krioprotektorom i vitrifikaciju u mozgovima kunića i svinja.
Studija iz 2015. izvijestila je o jasnim membranama, sinapsama, vezikulama, mijelinu i unutarstaničnim strukturama nakon zagrijavanja i pripreme za elektronsku mikroskopiju.
Pokazala je da izvrsna neuralna ultrastruktura može preživjeti ciklus pohrane bez leda u velikim mozgovima.
Nije pokazala oporavak sposobnosti za život. Fiksacija aldehidom namjerno umrežava biološki materijal i nespojiva je s uobičajenom obnovom živih funkcija.
Pokus je stoga odgovorio na strukturno pitanje, a ne na cjelovito pitanje oživljavanja.
Njegov širi doprinos bio je metodološki: očuvanje treba prosuđivati pregledom struktura od interesa, a ne samo opažanjem da uzorak izgleda staklasto.
2023.: nanozagrijavanje rješava zagrijavanje u štakorskim bubrezima
Hlađenje je samo polovica povratne krioprezervacije. Zagrijavanje je često teže.
Ako je zagrijavanje prespora, led može rasti tijekom devitrifikacije. Ako toplina dolazi uglavnom s površine, toplinski gradijenti mogu razlomiti organ.
Nanozagrijavanje rješava oba problema raspoređivanjem nanočestica željeznog oksida kroz krvožilni sustav i njihovim zagrijavanjem izmjeničnim radiofrekvencijskim magnetskim poljem.
Godine 2023. istraživači su vitrificirali štakorske bubrege, pohranili ih do 100 dana, nanozagrijali ih i presadili.
Oporavljeni bubrezi vratili su bubrežnu funkciju koja održava život u primateljima bez vlastitih bubrega tijekom opisanog praćenja.
Postignuće je ovisilo o više od zagrijavanja. Tim je prešao na manje toksičnu formulaciju i modelirao unošenje krioprotektora radi poboljšanja koncentracije u tkivu.
To je pouka koja se ponavlja u povijesti vitrifikacije: rješavanje jednog uskog grla otkriva sljedeće, a uspješan oporavak zahtijeva cijeli lanac.
Od 2024. do 2026.: veći fizički sustavi i funkcionalno živčano tkivo
Godine 2024. istraživači su izvijestili o fizikalnoj vitrifikaciji na mjerilu ljudskog organa u sustavima od 0.5 do 3 litre.
Kombinirali su unutarnju termometriju, žarenje, kontrolirano hlađenje i pregled mikro CT snimkom. Pokazali su i nanozagrijavanje u volumenima do 2 litre.
Najveće demonstracije bile su prvenstveno fizikalne. Izbjegavanje vidljivog leda i pukotina nužno je, ali ne dokazuje biološki oporavak organa ljudske veličine.
Godine 2026. studija u časopisu PNAS izvijestila je o kratkotrajnom funkcionalnom oporavku hipokampalnog tkiva odraslog miša nakon vitrifikacije i zagrijavanja.
Studija je mjerila morfologiju, mitohondrijsku reaktivnost, podražljivost neurona, sinaptički prijenos i dugotrajnu potencijaciju.
Obuhvatila je rezove mišjeg mozga i pripravke cijelog mozga s niskim prinosom, a ne ljudski mozak. Njezino je značenje uže, a i dalje znatno.
Pokazala je da živčano tkivo odraslog sisavca može oporaviti elektrofiziološke funkcije nakon što je molekularna pokretljivost prestala u staklastom stanju.
Ljudska biostaza nasljeđuje tu znanost u težim uvjetima
Pokusi s pohranom organa počinju sa zdravim tkivom, nadziranim vremenskim rasporedom i planiranim pristupom krvožilnom sustavu.
Ljudska biostaza počinje nakon pravne smrti. Bolest, topla ishemija, zgrušavanje, edem, prijevoz i bolest krvnih žila mogu narušiti dostavu krioprotektora.
Neposredni cilj jest strukturno očuvanje za moguć budući popravak, a ne današnja povratna presadba.
Ta je razlika razlog zašto se laboratorijske tvrdnje ne mogu izravno preslikati u tvrdnje o pacijentima.
Kako je Tomorrow.bio prilagodio vitrifikaciju terenskim uvjetima
Tomorrow.bio je premjestio krioprotektivnu perfuziju cijelog tijela u specijalizirana vozila hitne pomoći. Postupak može započeti blizu pacijenta umjesto čekanja na prijevoz u Švicarsku.
To mijenja važan ulazni čimbenik koji kemija ne može popraviti: količinu ishemije prije perfuzije.
Sadašnji protokol upotrebljava kemiju otopine utemeljenu na VM-1, prilagođenu terenskoj kriozaštiti i naknadnom prijevozu na suhom ledu.
Istraživački program EBF-a ispitao je VM-1 u simuliranim postmortalnim uvjetima, uključujući tri sata tople ishemije.
Program je mjerio venski indeks loma, trajanje perfuzije, promjenu težine, smanjenje mozga i stvaranje leda uz ispitivanje promjena u perfuzatu i postupku.
To je praktična granica za ljudske slučajeve: nije pitanje može li se idealna otopina vitrificirati, nego koliko se dobro može perfundirati stvaran ishemičan pacijent.
Mjerenje je postalo dio postupka
Rana istraživanja vitrifikacije često su utvrđivala uspjeh prozirnošću, kalorimetrijom, rendgenskom difrakcijom, preživljenjem ili funkcijom nakon zagrijavanja.
Ljudska biostaza ne može upotrijebiti oporavak kao današnju krajnju točku. Zato su joj potrebne nerazorne i uzorkovane mjere kvalitete očuvanja.
Tomorrow.bio svakog pacijenta snima CT uređajem na istoj temperaturi tekućeg dušika kako bi procijenio raspodjelu krioprotektora i uočio led ili makroskopske nedostatke u standardiziranim uvjetima.
Uz zaseban pristanak, neuralni mikrouzorci mogu poduprijeti procjenu membrana, sinapsi i lokalne ultrastrukture elektronskom mikroskopijom.
Te metode i njihova ograničenja opisani su u tekstu postupci provjere kvalitete biostaze.
Mjerenje mijenja i sam razvoj. Kada neuspjeh postane vidljiv i usporediv među slučajevima, promjene u kemiji i protokolu mogu ga ciljati.
Što je poboljšano, a što nije riješeno
Moderna vitrifikacija postigla je nekoliko stvari koje rano smrzavanje nije moglo:
- Očuvanje mnogih stanica, embrija i malih tkiva bez leda.
- Funkcionalni oporavak vitrificiranih životinjskih organa u određenim pokusima.
- Strukturno očuvanje na razini sinapsi u fiksiranim mozgovima sisavaca.
- Računalno vođeno hlađenje i žarenje većih sustava.
- Volumetrijsko zagrijavanje tehnologijama kao što je nanozagrijavanje.
- Metode CT snimanja i elektronske mikroskopije za mjerenje stvarnih ishoda očuvanja.
Nije proizvela povratnu krioprezervaciju cijelog ljudskog tijela.
Preostali problemi uključuju postmortalnu ishemiju, neravnomjernu perfuziju, toksičnost krioprotektora, učinke na krvno-moždanu barijeru, toplinske gradijente u cijelom tijelu, izbjegavanje pukotina i sigurno ravnomjerno zagrijavanje.
Čak bi i uspješno strukturno očuvanje ostavilo buduće probleme popravka, oživljavanja i liječenja izvornog uzroka smrti.
Te su razlike razrađene u tekstu tehnički izazovi povratne krioprezervacije.
TL;DR: Vitrifikacija je napredovala boljim krioprotektorima, perfuzijom, nadzorom leda, hlađenjem, zagrijavanjem i mjerenjem strukture. Neki su problemi riješeni na malim mjerilima, dok povratnost za cijelo ljudsko tijelo ostaje neriješena.
Istražite ovaj praktični alat
Upotrijebite interaktivni alat za istraživanje pitanja u ovom članku.
Učitavanje interaktivnog alata...
Dodatna literatura